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    小分子靶點篩選服務


    雷公藤又名“斷腸草”,是中醫藥寶庫中著名的“以毒攻毒”的神秘藥物,與砒霜齊名。2007年,雷公藤紅素、青蒿素、雷公藤甲素、辣椒素和姜黃素被《Cell》雜志列為最有可能也最值得開發為現代藥物的五種天然化合物。雷公藤紅素(celastrol)是雷公藤的主要活性成分,被廣泛用于各種炎癥、免疫紊亂及心血管疾病的治療中。


    低劑量的雷公藤紅素被發現具有保護心血管的作用,是高血壓性心臟病的“護心丸”,但其潛在藥物機理并不明確。2020年4月,溫州醫科大學藥學院梁廣教授與溫州醫科大學附屬第一醫院心內科黃偉劍教授課題組,聯合攻關,綜合運用Huprot 20K人類蛋白質組芯片表面等離子共振(SPR)計算機模擬分子對接技術等為雷公藤紅素找到了新的分子靶點,確定雷公藤紅素通過與STAT3直接結合,抑制血管緊張素(AngⅡ)誘導的心功能障礙的明確藥物機理。相關研究成果于2020年4月發表于頂級心血管研究雜志《Circulation Research》(IF=15.9)上。本文應用的實驗技術路線可以為廣大小分子藥物研究工作者提供思路借鑒。


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    表型確認

    雷公藤紅素抑制AngⅡ誘導的心肌細胞異常

    為了確定雷公藤紅素在心肌細胞異常中的作用,作者用1 mol/L AngⅡ處理大鼠原代心肌細胞和H9C2細胞6h。結果發現AngⅡ處理顯著增加了原代心肌細胞和H9C2細胞中β-MyHC(肥大標志物)、TGF-β1(纖維化標志物)和膠原蛋白I(COL I)mRNA的表達水平,說明造模成功。而雷公藤紅素施用后可呈劑量依賴性地抑制AngⅡ誘導的基因表達(圖1A、B)。進一步,研究人員對原代心肌細胞和H9C2細胞進行了羅丹明蛋白染色,結果顯示:雷公藤紅素降低了AngⅡ誘導的心肌細胞大小增加(圖1C)。上述結果表明,雷公藤紅素可以緩解AngⅡ誘導的心肌細胞異常現象。

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    圖1 雷公藤紅素可以緩解Ang II誘導的心肌細胞異常

    靶點篩選

        

    20K蛋白質組芯片篩選雷公藤紅素結合靶蛋白

    為了探索雷公藤紅素緩解AngⅡ誘導的心肌細胞異常的潛在機理,該研究運用Huprot 20K人類蛋白質組芯片(覆蓋2萬多種人類全長蛋白)技術對雷公藤紅素的靶蛋白進行了廣泛篩選。將雷公藤紅素通過羥基羧合的方式標記上生物素Biotin(圖2A),將生物素化的雷公藤紅素與Huprot 20K人類蛋白質組芯片進行孵育,利用Cy3-SA-Biotin標記體系進行示蹤,識別雷公藤紅素直接結合的靶蛋白(圖2B)。芯片篩選結果顯示,雷公藤紅素具有明顯的多靶點調控特點,可以和大批量蛋白質結合(圖2C)。通過蛋白相互作用(PPI)結合蛋白家族(Protein Family)富集分析發現,雷公藤紅素與Prdx(過氧化物還原酶)家族、Vps27-Hrs-STAM結構域蛋白和STAT家族蛋白結合富集性最高(圖2D)。這一結果也得到了轉錄組數據的證實。


    然而,將H9C2細胞中Prdx1/2敲減后并沒有改善AngⅡ引起的心肌細胞基質蛋白表達和細胞肥大現象。而目前也沒有報道表明Vps27-Hrs-STAM結構域蛋白與心肌細胞變化和AngⅡ有關。因此,研究人員將目標聚焦在富集分析排在第三位的STAT蛋白家族上(圖2D)

    前人研究發現,STAT3在保護心肌細胞異常激活及心肌肥大方面發揮著重要作用。20K蛋白質組芯片也顯示雷公藤紅素與STAT3的結合的信噪比(SNR)達到3.95,十分顯著(圖2E),這表明STAT3很可能是雷公藤紅素治療心臟病的主要靶點蛋白

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    圖2 雷公藤紅素結合靶蛋白篩選實驗

    靶點驗證

    SPR與分子對接確認雷公藤紅素靶蛋白STAT3

    研究人員首先通過表面等離子共振技術(SPR)體外驗證了雷公藤紅素可以與rhSTAT3(重組人STAT3)直接結合,解離平衡常數KD(M)為15.73 μmol/L(圖3A),說明二者具有較強的結合力。為了進一步驗證兩者的結合作用,研究人員通過競爭ELISA實驗證實了生物素標記的雷公藤紅素與rhSTAT3的結合現象可以被高濃度的非標記雷公藤紅素競爭性抑制,再次證實了雷公藤紅素可以與rhSTAT3直接結合(圖3B)。

    同時,通過pull-down實驗,研究人員證實了雷公藤紅素與STAT3蛋白在H9C2細胞(圖3C)和心肌組織中也直接結合(圖3D)。并且在原代心肌細胞中證實雷公藤紅素與STAT3上游的蛋白IL-1R、JAK不能結合(圖3E)。

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    圖3 雷公藤紅素結合靶蛋白驗證

    分子對接

    篩選和驗證雷公藤紅素結合的靶蛋白位點

    為了進一步明確雷公藤紅素與STAT3的結合位點,研究人員應用計算機模擬分子對接技術,在CCD和SH2兩個STAT3經典domain中對100個氨基酸殘基位點進行分子對接模擬,確定了CC domain中的Leu-207殘基和SH2 domain中的Gln-635和Val-637殘基與雷公藤紅素具有最小的結合能(圖4A、C),顯示該3個氨基酸殘基組成的對接位相結構(dock)是雷公藤紅素結合和調控STAT3的關鍵區域(圖4B、D)。進一步,研究人員通過氨基酸突變的方式,證實了分子對接模擬的結果,即雷公藤紅素確實結合在STAT3的Leu-207、Gln-635和Val-637殘基構成的dock中(圖4E)。

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    圖4 雷公藤紅素與STAT3結合位點確認

    機理發現

    雷公藤紅素抑制STAT3核轉移治療心肌肥大

    為進一步確定雷公藤紅素如何通過抑制STAT3治療心肌肥大的具體機理,研究人員首先構建了STAT3沉默和STAT3過表達的質粒轉入原代心肌細胞中,并對其進行AngⅡ和雷公藤紅素處理。結果顯示,AngⅡ誘導的β-MyHC(肥大標志物)和TGF-β1(纖維化標志物)高表達,在施用雷公藤紅素和沉默STAT3后,這些心肌肥大標志物的表達均受到顯著抑制(圖5A)。同時,在施用雷公藤紅素后,STAT3的磷酸化水平也受到了一定程度的抑制(圖5B)。

    研究人員進一步利用Ang II微泵和主動脈縮減術誘導小鼠心肌細胞異常,將STAT3抑制劑S3I-201 (S3I)和雷公藤紅素分別適用于模型小鼠,心臟組織H&E染色結果顯示雷公藤紅素和S3I均能減弱Ang II引起的的組織病變和心肌細胞肥大(圖5C)。

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    圖5 雷公藤紅素抑制Ang II引起的心肌肥厚和纖維化

    為了進一步了解雷公藤紅素是如何影響STAT3而對AngII誘導的心肌細胞異常產生作用的。作者選用Tyr-705位點磷酸化的STAT3蛋白(p-STAT3)作為STAT3激活的標志。研究發現雷公藤紅素預處理可以抑制Ang II誘導的原代心肌細胞STAT3 Tyr-705位點磷酸化。由于計算機模擬分子對接中雷公藤紅素與STAT3結合的關鍵氨基酸殘基是導致STAT3蛋白發生核移位的關鍵區域。因此,研究人員通過檢測STAT3蛋白在胞核和胞質組分中的表達,發現雷公藤紅素可以減少AngII介導的STAT3在原代心肌細胞中向細胞核內的移位(圖6A、B)。

    前人研究表明,KPNA3蛋白是STAT3核轉移的載體蛋白,于是,研究人員在心肌細胞中利用免疫共沉淀技術證實了STAT3與KPNA3確實存在結合,而雷公藤紅素可以抑制STAT3-KPNA3復合物的形成(圖6C)。由于STAT3入核后會介導一系列與心肌肥大和纖維化相關的基因轉錄,研究人員利用染色體免疫共沉淀(CHIP)結合RT-PCR技術證實了在初始心肌細胞中STAT3確實可以與myh7、 Col1a和 Tgfb1等基因結合(圖6D)。

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    圖6雷公藤紅素抑制STAT3入核調控心肌肥大基因表達

    綜合上述研究,研究人員通過人類蛋白組芯片技術、表面等離子共振技術及計算機模擬分子對接技術(華盈生物均可提供全套服務)發現了雷公藤紅素結合的新靶點STAT3,并通過一系列體外/體內功能實驗和Rescue實驗,最終明確雷公藤紅素是通過結合STAT3的第207位氨基酸,進而抑制了Ang II誘導的STAT3入核發揮轉錄因子作用(即STAT3與myh7 Col1a Tgfb1等基因結合,介導這些心肌肥厚和纖維化相關基因的表達),來達到治療和預防高血壓性心臟病的藥物機理(圖7)。

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    圖7 雷公藤紅素抑制Ang II引起的心肌肥厚和纖維化機理

    技術路線

    華盈視角:現代藥物靶點-機理研究的技術路線已經非常清晰,技術組合也比較成熟,如果廣大研究人員手上也有被證實臨床藥效的活性小分子單體,完全可以按照本文的技術路線進行深入研究,獲得一篇高質量的藥物靶點-機理研究論文。

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    中醫中藥是個大寶庫,由于很多中藥本身具有明確的臨床療效。因此,只要對中藥和中藥單體化合物的治療機理進行深入研究,不僅可以為開發新藥物提供科學基礎,而且對于認識疾病的發病機理和找到新的治療靶點也將起到至關重要的作用。

    文獻原文

    Ye Shiju,Luo Wu,Khan Zia A et al. Celastrol Attenuates Angiotensin II-Induced Cardiac Remodeling by Targeting STAT3.[J] .Circ. Res., 2020, 126: 1007-1023.

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